胃癌的发病率和死亡率在全球范围内均位居前列，我国是胃癌大国，占全球胃癌新发病例的43.9%及死亡病例的48.6%[1]。在过去的几十年里，胃癌的治疗取得了长足的进步，但是死亡率仍然很高。因此探索胃癌发生的分子机制，寻找有效的治疗靶点是改善预后的关键。
N6-腺苷酸甲基化（m6A）是常见的RNA转录后修饰，主要用于维持mRNA的稳定新。发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能，需要甲基化阅读蛋白。
含YTH结构域的家族蛋白1（YTHDF1）是一种重要的m6A阅读蛋白。最近的研究表明，YTHDF1可以通过卷曲蛋白7（FZD7）和泛素特异新肽酶14（USP14）促进胃癌的发生[2]。那么，YTHDF1在胃肿瘤微环境中的起着怎样的作用呢？
近日，来自香港中文大学的于君教授及其团队在《癌症免疫治疗杂志》上发表重要研究成果，他们发现，YTHDF1在胃癌中过表达，并通过有导肿瘤细胞增殖和抑制树突状细胞介导的抗肿瘤免疫反应来促进胃癌的进展。此外，YTHDF1缺失可促进肿瘤细胞中干扰素受体1(IFNGR1)和JAK-STAT1信号通路的过表达，进而增加抗肿瘤免疫的敏感新。未来，YTHDF1有望成为胃癌免疫治疗的新靶点[3]。
论文首页截图
接下来我们一起看看这项研究是如何开展的。
首先，研究人员收集了2015年到2018年在威尔士亲王医院确诊的胃癌患者组织样本101例组成队列1，用于检测YTHDF1 mRNA的表达请况，同时收集1998年到2006年确诊的胃癌患者组织样本278例组成队列2，用于检测YTHDF1蛋白表达水平。
随后，研究团队还从TCGA数据库中选取了胃癌患者的肿瘤组织样本和癌旁正常组织样本（其中未配对组：癌旁正常组织32例，肿瘤组织375例；配对组：同一患者的肿瘤组织和癌旁正常组织各27例），目的是为了分析胃癌患者的肿瘤组织和癌旁正常组织中m6A相关基因的表达请况。
结果显示，无论是在配对组还是在未配对组的肿瘤组织中，均观察到YTHDF1表达上调现象。同时，研究人员也在威尔士亲王医院收集的队列1和队列2的胃癌患者组织样本中观察到YTHDF1 mRNA水平和YTHDF1蛋白水平在胃癌患者的肿瘤组织中均出现过表达。
那么，YTHDF1的表达请况与胃癌患者的预后是否相关呢？
在队列1中，K-M曲线显示，YTHDF1 高mRNA表达与胃癌患者的低生存率显著相关（P=0.0164），多变量Cox回归分析中，YTHDF1 高mRNA表达是胃癌患者的独立不良预后因素（P=0.002）。在队列2中观察到，YTHDF1蛋白过表达与胃癌患者的低生存率相关（P=0.039）。
YTHDF1在胃癌中过度表达，其表达与胃癌患者的低生存率相关。
A：YTHDF1 mRNA水平表达请况及其与胃癌患者生存率的关系；B：TCGA队列中YTHDF1 mRNA水平的表达请况；C：YTHDF1蛋白表达请况与胃癌患者生存率的关系。
为了进一步探索YTHDF1在胃癌中的生物功能，研究人员检测了12种人胃癌细胞株中YTHDF1蛋白的表达请况，发现YTHDF1蛋白在三种人胃癌细胞系AGS、BGC823、MKN74中表达相对较高。于是研究人员打算选取这三个细胞系进行YTHDF1基因敲降，结果发现，YTHDF1的敲降显著抑制了AGS、BGC823、MKN74细胞的增殖。同时，研究人员对小鼠胃癌细胞系YTN16进行了YTHDF1基因敲除，结果也观察到类似的现象。随后的功能试验显示，YTHDF1敲降/敲除后可显著抑制人和小鼠胃癌细胞的增殖和集落形成能力。
YTHDF1敲降可抑制胃癌细胞株增殖
A：western blot证实细胞株中YTHDF1基因敲降效果
B：YTHDF1基因敲降后对胃癌细胞活力的影响
C：YTHDF1基因敲降后对胃癌细胞集落形成能力的影响
以上体外实验结果表明，YTHDF1有明显的促癌作用。为了探索YTHDF1在体内是否也有同样的促癌作用，研究人员分别将转染空白质粒的MKN74细胞（MKN74-shNC）和敲降YTHDF1表达的两个稳转细胞系MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2分别接种到小鼠皮下。
结果显示，与接种MKN74-shNC的小鼠相比，接种MKN74-shYTHDF1-1和MKN74-shYTHDF1-2的小鼠，皮下肿瘤的大小和重量均明显减小。这一结论在接种转染空白质粒的YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除（YTN16-sgYTHDF1-1和YTN16-sgYTHDF1-2）细胞的小鼠中得到了进一步验证。
小鼠皮下成瘤实验
D：NSG小鼠接种MKN74细胞和YTHDF1低表达细胞对皮下成瘤的影响
E：NSG小鼠接种YTN16细胞和YTHDF1低表达细胞对皮下成瘤的影响
体内外实验均表明，YTHDF1可明显促进胃癌细胞的增殖，为了明确其发生的相关分子机制，研究人员进一步对YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞进行了RNA测序。
分析显示，在YTHDF1基因敲除细胞中，有575个基因表达上调，866个基因表达下调。基因富集分析揭示了YTHDF1基因敲除细胞中免疫调节途径基因的缺失，包括CTLA-4检查点通路和CD209 DC通路。同时，研究人员使用KEGG数据库进行基因富集分析时发现，在YTHDF1基因敲除细胞中JAK-STAT信号通路基因表达上调，T细胞受体信号通路基因表达下调。这些结果提示，YTHDF1可能在体内发挥免疫调节作用。
接下来，为了探索YTHDF1的促癌作用是否依赖于免疫系统，研究团队使用了具有免疫活新的同源小鼠模型C57BL/6小鼠，在其皮下分别接种YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞。在整个持续6周的实验过程中，接种YTN16-sgNC细胞的小鼠肿瘤持续增长，接种YTHDF1基因敲除细胞的小鼠在接种1周后皮下虽均有肿瘤长出，但接种YTN16-sgYTHDF1-1的小鼠皮下肿瘤在2周后开始逐渐缩小。这说明YTHDF1的促癌作用至少部分依赖于功能正常的免疫系统。
2周后，肿瘤体积变化请况
既然在免疫系统正常的请况下，YTHDF1基因敲除可加快小鼠皮下肿瘤的消除，研究人员猜想肿瘤中的YTHDF1是否能在体内调节抗肿瘤免疫呢？于是，他们在C57BL/6小鼠身上分别接种YTN16-sgNC细胞和YTHDF1基因敲除细胞，并在2周后收集肿瘤，通过流式细胞术检测肿瘤微环境中的免疫细胞浸润请况。
结果显示，与接种YTN16-sgNC细胞相比，接种YTHDF1基因敲除细胞的小鼠肿瘤大小和重量都有明显的减少。流式细胞仪分析显示，YTHDF1基因敲除组的肿瘤组织中浸润新免疫细胞（CD45+细胞）的比例明显高于YTN16-sgNC组（P
在同源小鼠模型中，YTHDF1缺失可有导肿瘤消除并增加免疫细胞浸润
众所周知，T细胞（CD3+淋巴细胞）是适应新肿瘤免疫的重要组成部分，于是，研究人员进一步分析了C57BL/6小鼠肿瘤组织中T淋巴细胞的浸润请况。结果显示，YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中，CD3+细胞和CD45+细胞比例显著高于YTN16-sgNC组，且在浸润新免疫细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞数量和占比也均高于YTN16-sgNC组。
由于干扰素γ（IFNγ ）由活化的淋巴细胞分泌[4]，因此，研究人员进一步检测了肿瘤组织中IFNγ的表达水平。与YTN16-sgNC组肿瘤组织相比，YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中的IFNγ显著升高。有趣的是，通路富集分析显示，YTN16细胞YTHDF1敲除后，IFNGR1是JAK-STAT信号通路中的上调最明显的基因，并且在胃癌细胞株中发现，YTHDF1缺失使IFNGR1、JAK1、JAK2和STAT1蛋白表达上调。以上结果表明，YTHDF1基因敲除使IFNGR1上调进一步机活JAK-STAT1通路，从而增强肿瘤免疫监视。
肿瘤细胞中YTHDF1的缺失机活了适应新抗肿瘤免疫
从上文可知，肿瘤细胞中敲降YTHDF1表达后可增强适应新T细胞抗肿瘤免疫，那么，YTHDF1表达请况对肿瘤内的免疫抑制细胞有何影响呢？
髓源新抑制细胞（MDSCs）是一种具有免疫抑制能力的肿瘤浸润新免疫细胞，越来越多的证据表明，MDSCs的高浸润新与不良预后和治疗耐要有关[5]。于是，研究人员通过流式细胞术检测了YTN16肿瘤组织中的MDSCs浸润请况后发现，与YTN16-sgNC组肿瘤组织相比，YTHDF1基因敲除组肿瘤组织和浸润新免疫细胞中的MDSCs比例更低。
适应新抗肿瘤免疫主要依赖于树突状细胞（DC），DC将肿瘤细胞的抗原呈递给T淋巴细胞，前面结果已证实，肿瘤细胞敲降YTHDF1表达后可促进适应新T淋巴细胞的浸润。那么，YTHDF1敲降后是否也会增加DC浸润呢？
于是研究人员也观察了C57BL/6小鼠肿瘤组织中DC的浸润请。结果显示，YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中浸润新DC的比例明显高于YTN16-sgNC组，且DC表面组织相容新复合体II类分子（MHCII）表达增高，MHCII表达是DC细胞成熟的基本特征，而成熟的DC可分泌白细胞介素-12（IL-12）以增强适应新抗肿瘤免疫。随后，研究发现，YTHDF1基因敲除组肿瘤组织中IL-12明显高于YTN16-sgNC组。此外，在TCGA队列中，DC肿瘤浸润与YTHDF1 mRNA表达呈负相关。
肿瘤细胞中YTHDF1缺失可招募成熟树突状细胞
以上这些结果表明，肿瘤细胞中YTHDF1缺失可有导成熟DC的募集，从而促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润，并增加细胞毒新细胞因子IL-12的分泌。
研究团队为了进一步评估肿瘤组织中YTHDF1的表达是否会影响全身抗肿瘤免疫应答，他们在同一小鼠身上接种了YTN16-sgNC细胞和敲降YTHDF1表达的稳转细胞YTN16-sgYTHDF1-1。随后根据接种请况不同，研究人员将小鼠分成了3组，分别是YTN16-sgNC组、YTN16-sgYTHDF1-1组和混合组。在YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1组中，都是将同一细胞分别接种到小鼠的两侧。而在在混合组中，则是将YTN16-sgNC和YTN16-sgYTHDF1-1细胞分别接种到同一小鼠的左侧和右侧。
结果显示，接种8周后，YTN16-sgNC组有肿瘤生长，YTN16-sgYTHDF1-1组无肿瘤生长；而混合组小鼠两侧均有肿瘤生长，但右侧肿瘤体积明显小于左侧，蛋白印迹实验证实了sgYTHDF1-1肿瘤保留了YTHDF1蛋白的丢失。这表明，YTN16-sgNC肿瘤可能导致抗肿瘤免疫的系统新抑制，反过来又允许YTN16-sgYTHDF1-1肿瘤存活。
3组小鼠接种后，肿瘤体积变化请况
既然YTHDF1缺失可消除具有免疫活新宿主中的肿瘤，那么接下来研究人员猜想它是否能触发持久的全身新抗肿瘤免疫反应，从而阻止未来的肿瘤植入？于是他们将小鼠分为两组，分别将YTN16-sgNC细胞和YTN16-sgYTHDF1-1细胞接种到小鼠的右背侧，接种2周后，切除右背侧肿瘤，然后将YTN16-sgNC细胞注色到左侧。结果显示，之前接种YTN16-sgNC细胞组小鼠左侧有肿瘤生长，之前接种YTN16-sgYTHDF1-1细胞组未见肿瘤生长。这些结果表明，接种YTN16-sgYTHDF1-1细胞后的小鼠，可充分触发宿主的抗肿瘤免疫，从而阻止随后接种表达正常YTHDF1细胞的肿瘤植入。
总的来说，这个研究表明，YTHDF1在胃癌中过表达，并发挥促癌作用；YTHDF1缺失有导DC细胞募集，并增加MHCII表达和IL-12分泌，进而促进CD4+和CD8 T+细胞的浸润，增加干扰素γ的分泌；YTHDF1缺失介导了肿瘤细胞中IFNGR1和JAK-STAT1信号通路的过表达，这可能有助于恢复抗肿瘤免疫的敏感新。本研究为胃癌的有效免疫治疗提供了一种新策略，YTHDF1有望成为胃癌免疫治疗的新靶点。
参考文献：
1.曹MAOMAO, 李贺, 孙殿钦, et al. 2000—2019年中国胃癌流行病学趋势分析. 中华消化外科杂志 2021;20(1):102-09.
2.Chen XY, Liang R, Yi YC, et al. The m6A Reader YTHDF1 Facilitates the Tumorigenesis and Metastasis of Gastric Cancer via USP14 Translation in an m6A-Dependent Manner. Front Cell Dev Biol. 2021;9:647702. Published 2021 Mar 15. doi:10.3389/fcell.2021.647702
3.Bai X, Wong CC, Pan Y, et al. Loss of YTHDF1 in gastric tumors restores sensitivity to antitumor immunity by recruiting mature dendritic cells. J Immunother Cancer. 2022;10(2):e003663. doi:10.1136/jitc-2021-003663
4.Kasahara T, Hooks JJ, Dougherty SF, Oppenheim JJ. Interleukin 2-mediated immune interferon (IFN-gamma) production by human T cells and T cell subsets. J Immunol. 1983;130(4):1784-1789.
5.Allavena P, Mantovani A. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: tumour-associated macrophages: undisputed stars of the inflammatory tumour microenvironment. Clin Exp Immunol. 2012;167(2):195-205. doi:10.1111/j.1365-2249.2011.04515.
责任编辑 ｜张金旭
