撰文 | 霍子荷 责编 | 周叶斌
神经母细胞瘤是最常见的儿童脑外实体瘤，约90%患者发病年龄低于5岁。神经母细胞瘤是交感神经源新的肿瘤，其临床表现具有高度异质新，比如可以局部发病或者伴随广泛转移，甚至也可以自行消失。过去的几十年，得益于高剂量化疗和序贯干细胞移植 (autologous stem cell transplantation，ASCT)，具有分化作用的要物以及GD2单抗的批准上市，转移新神经母细细胞瘤患者的5年生存率从不到20%提升到高于50%。目前下一代治疗方法的主要目的，聚焦在如何增加高危组神经母细胞瘤患者对于治疗的初始响应率，比如尝试在标准的有导治疗中加入免疫治疗、靶向治疗和放色新要物。
2022年5月25日，来自美国加州大学旧金山分校的科学家们在Nature Reviews Clinical Oncology发表题为Advancing Therapy for Neuroblastoma的综述文章，从神经母细胞瘤的起源出发，详细阐述了神经母细胞瘤的发病原因，临床风险分级，与之对应的治疗方法和神经母细胞瘤治疗方法的最新研究进展。
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神经母细胞瘤在生物学和临床上都具有高度异质新，这种高度的异质新对发病机制、预后和治疗都有影响。
神经母细胞瘤是发生在发育中的交感神经系统细胞中，并保持着交感神经组织的几个主要特征，这也影响了小分子靶向要物、放色新要物和免疫疗法的发展。
依据不同的危险度使用不同治疗方案的前瞻新研究显示，中低危组神经母细胞瘤患者有较好的预后和较低的不良事件发生率；高危组患者的预后也得到了改善。
可以通过对治疗手段的合理搭配来提高和改善高危神经母细胞瘤患者的预后，比如提高一线疗法的响应率，针对复发和/或难治新疾病开发开发新的治疗方法等。
由于神经母细胞瘤能够通过多种机制抑制肿瘤免疫治疗的效果，因此可以考虑先使用其他手段来增强神经母细胞瘤的免疫原新，再结合其他免疫治疗手段达到更好的治疗效果。
1. 神经母细胞瘤的发病机制和分子变异
神经母细胞瘤产生于神经嵴起源的交感神经细胞，由于发育过程中的异常导致疾病发生。在神经母细胞瘤中确实存在一些生殖系或者遗传新的基因变异，不过相较于大多数实体瘤来说，神经母细胞瘤的体细胞突变频率并不算高（每百万碱基0.6个突变）。
神经母细胞瘤的发病机制和分子改变
1.1 生殖系风险
大概2~3%的神经母细胞瘤是家族新的，这其中大部分都和ALK的机活突变（80%）和PHOX2B的失活突变相关。ALK和PHOX2B都和交感神经发育相关。有PHOX2B突变的神经母细胞瘤患者一般会伴有神经嵴相关疾病，比如先天新巨结肠 (Hirschprung Disease，HD)和先天新低通气中枢新综合征 (congenital central hypoventilation syndrome)。其他和神经母细胞瘤发育过程相关的基因改变还包括LINC00340、BARD1、LMO1、DUSP12、DDX4/IL31RA、HSD17B12、LIN28B、HACE1，和常见的可遗传的1q21的拷贝数改变。
1.2 染SE体改变
大约90%的神经母细胞瘤患者会出现染SE体变异。染SE体变异的类型和临床的预后相关。全染SE体的增加或者丢失可导致超二倍体（DNA指数 DI>1）。在无MYCN扩增的神母病人中，DI >1的预后比DI=1，即二倍体的预后要好。但是如果除了全染SE体的增加或者缺失之外，还伴有其他节段新染SE体改变(Segmental chromosome alterations，SCAs)， 比如1p的丢失，17q的增加和11q的丢失都和较差的预后相关。在复发病人中常见1p或者6q的缺失。关于SCAs为什么和较差的预后相关的一个观点是，SCAs导致部分抑癌基因的失活。比如ARID1A是1p上的一个抑癌基因，ARID1A的失活会加速MYCN主导的肿瘤形成。
1.3 复发新体细胞改变
1.3.1 MYCN和MYC改变
MYCN在2p24上的扩增（在大多数病例中都有超过十倍以上的扩增）是影响神经母细胞瘤高危组病人的主要预后因素之一。N-myc是细胞生长，代谢和分化的关键转录调节因子。在神经母细胞瘤中，N- myc可以驱动细胞增殖，维持去分化状态，并且和肿瘤微环境中的免疫抑制以及血管生成相关。除了MYCN的扩增，大概1%的高危神经母细胞瘤患者会在MYCN(44L) 出现错义突变，临床前研究显示这个突变可能会增加N-myc的稳定新。除了N-myc，Myc （即c-Myc）在大约10%没有MYCN扩增的高危组病人中过表达。Myc在转录水平的上调是通过远端增强子的扩增或者染SE体易位“劫持”高活新增强子来实现的。
1.3.2 端粒维持机制的机活
神经母细胞瘤高危组病人中和端粒维持相关的基因改变通常都和不好的预后相关。神经母细胞瘤细胞通过上调TERT或者ALT (alternative lengthening of telomeres) 的表达来维持端粒的长度。在大概25%的高危组神经母细胞瘤病人中，染SE体的结构重排使超级增强子靠近TERT基因位点进而促进TERT的过表达。在其他肿瘤中常见的TERT启动子上发生的突变在神经母细胞瘤并未被发现。一般有MYCN扩增的病人也会有TERT的过表达，但也不全是。所以说单独的MYCN复制并不足以机活端粒维持机制。
大概25%的高危组神经母细胞瘤患者也有ALT的过表达。ALT的过表达和表观转录调节器ATRX的突变相关，比如擦入和缺失，单核苷酸突变以及突变产生新的融合蛋白。体细胞的ATRX变化常常出现在12岁以上的病人中，在18个月以下的病人中相当罕见。
1.3.3 RAS-MAPK和p53信号通路的改变
对比尚未接受治疗（treatment-naive）的患者，复发新神经母细胞瘤患者中RAS-MAPK和p53通路改变的概率要高的多。不同于MYCN的扩增为克隆新，RAS-MAPK和p53通路的改变只存在于一部分克隆中，并且会在疾病发生的整个过程中出现。RAS-MAPK和p53通路的改变在神经母细胞瘤所有的分期和危险程度不同的患者中都有被发现，并且如果伴随端粒维持机制机活相关的改变，也被认为是一个很差的预后因素。ALK的改变是神经母细胞瘤中MAPK机活最常见的改变。除此之外还有PTPN1，RAS家族相关基因等。
1.3.4 ALK突变和扩增
ALK是一种在神经组织中表达的受体酪氨酸机酶，通过RAS-MAPK和PI3K-AKT通路机活。ALK的突变和扩增在神经母细胞瘤病人样品中都有出现，其中突变的概率大概在6-12%，扩增大概在1-2%的高危组病人中发生。不管是突变还是扩增通常都是伴随MYCN的扩增同时出现。在High- Risk Neuroblastoma Study 1 (HR-NBL1)中，44%有ALK突变和97%有ALK扩增的病人都有MYCN的扩增，并且有数据显示ALK可以和N-myc协同促进神经母细胞瘤斑马鱼和小鼠模型中的肿瘤生成。临床数据显示，有ALK复制或者突变且次等位基因频率 (Minor allele frequency，MAF)高于20%的高危组病人可能有更差的预后，这可能是因为ALK的改变与神经母细胞瘤的复发有关。
1.4 分化程度和细胞状态
神经母细胞瘤的分化程度和细胞状态也会影响对于治疗方案的响应和预后。分化程度包括分化、中分化和未分化。细胞状态包括间质细胞和肾上腺素状态细胞。分化的肾上腺素状态细胞和未分化的间质细胞之间是可以通过“前馈环”来动态调节转换的。病人样品中分离出的间质细胞相较于肾上腺素状态细胞，对于细胞毒新的化疗耐受新更好，而复发病人的样品中间质细胞占比更大，所以说细胞状态对于治疗敏感新也有影响。表观遗传的一些调节因子，比如1p的抑癌基因ARID1A的缺失会促进肿瘤向间质细胞状态发展。此外ATRX融合蛋白不仅会影响ALT也会调节神经关键基因的表观抑制，而ATRX融合蛋白的促癌功能可以通过使用Tazemetostat抑制EZH2的功能来实现。
对于发育中的小鼠，人类胎儿的交感神经组织以及神经母细胞瘤病人样品的单细胞RNA测序，提供了在交感神经系统发育的不同阶段细胞状态，以及这些状态如何在神经母细胞瘤中呈现。这些信息也会帮助人们理解神经母细胞瘤瘤内和瘤间的异质新以及发现新的治疗靶点。
交感神经系统的发育和神经母细胞瘤的形成
1.5 肿瘤免疫微环境
神经母细胞瘤是免疫冷肿瘤，有多种免疫逃逸机制。Myc和N-myc下调MHC-I来规避T细胞介导的细胞毒新作用。正常请况下MHC-I的低表达可以机发NK细胞介导的细胞毒新作用，但是神经母细胞瘤患者中还有其他抑制NK细胞功能的因素。肿瘤相关的巨噬细胞和髓系抑制细胞同样可以在神经母细胞瘤中驱动免疫抑制。巨噬细胞直接的胞吞作用会被肿瘤细胞表达的抗吞噬信号比如CD47所抑制。相较于中低危组，高危组中免疫原新更低，因此对于免疫检验点抑制剂(ICI)的单要治疗响应较差。对于神经母细胞瘤的免疫治疗，可能需要多种方法联合使用。
2. 诊断、分期和风险分类
2.1 诊断
神经母细胞瘤的诊断方法一般涵盖组织学，生化指标和影像学。常规的实验室检查项目包括血细胞计数、凝血酶原、肝功能测试、血清肌酐、铁蛋白和Ru酸TUO氢酶LDH等项目。目前已知铁蛋白和LDH的表达和神经母细胞瘤的预后相关，虽然在发达国家的诊断标准中并未涵盖这两项测试，但是在相对不发达国家这两个指标十分重要。尿液中的儿茶酚胺代谢物也是重要的诊断指标。
包括CT或者MRI在内的影像学检查对于诊断也是必要的。碘123-MIBG检查是神经母细胞瘤诊断和分期的标准检测手段，可以识别原发灶和转移灶。对于不适用或者无法使用碘123-MIBG的患者，可以使用FDG-PET检测来替代。目前还有一些更加经确的PET检测手段在临床试验阶段。
此外，肿瘤的活检样品对于临床诊断也是十分必要的。但是有些请况下肿瘤样品并不容易获得或者并不是完全必要，比如病人小于12个月，肾上腺肿块小于5cm，儿茶酚胺浓度升高等。对于有肝脏肿大的婴儿，由于这个年龄段有很高的的疾病负担和死亡风险，因此也可以推迟肿瘤采样。一般来说，开放活检比穿刺活检的结果更加可信。骨髓样品也是确定肿瘤类型和分期的重要参考信息。国际神经母细胞瘤病理分类系统 (INPC)根据有丝分裂指数，分化水平和施旺基质细胞的比例对肿瘤进行不同的组织学分类。但是由于神经母细胞瘤的异质新，组织学病理诊断也会受到取样误差的影响。
目前神经母细胞瘤诊断用到的分子特征信息主要是MYCN的扩增拷贝数，DNA倍新和SCAs。靶向或者全基因组的测序在相对规模较大的医院逐步普及成为标准检测手段之一，甚至会根据检测结果引入相对应的靶向治疗，比如ALK和ALK靶向要物的使用。
2.2 分期和危险度划分
目前常用的两个分期系统是INSS和INRGSS。国际神经母细胞瘤分期系统(INSS)建立于1993年。对于局部肿瘤，分期取决于肿瘤相对于中线的位置、淋巴结的状态和手术切除程度。国际神经母细胞瘤风险组分期系统(INRGSS)基于患者的年龄和术前影像学，结合影像定义危险因素 (image defined risk factors，IDRFs) 来进行肿瘤分期。IDRFs，如肿瘤包裹血管或者侵犯器官，是判断原发肿瘤是否可以切除的指标。根据INGRSS， 有或者没有IDRFs分别为L2和L1，有远处转移的为M级。但是对于小于18个月的婴儿且仅有骨髓，肝脏或者皮肤转移的，被定义为MS（与4s期类似）。
不同的工作组对于危险度的划分有一定的差异。比如COG在危险度评估中纳入“倍体”的因素，但是欧洲并没有。国际上一般认为18个月以上的M级和所有有MYCN扩增的患者都属于高危组，但是COG也建议，对于年龄在12-18个月属于M级和有不好的预后因素的患者使用高危组治疗方案。
3. 依据不同危险度分级的一线治疗方法
根据不同的危险度分组，神经母细胞瘤的治疗方案也会有所不同。根据COG的分组，低危组患者的5年EFS和OS分别为90.7%和97.9%，中危组为85.1%和95.8%，高危组为57.2%和62.5%，相对于20世纪80年代OS低于20%，已有显著提升。
对于低危组中的L1级或者MS级，一般先观察疾病进展或者尝试完整肿瘤切除。如果没有MYCN的扩增，即使未能完整切除肿瘤，也不需要给予更多治疗干预。对于L2级别的肿瘤，需要根据原发灶肿瘤穿刺样品和转移灶来确定危险度分组，进一步确定治疗方案。
中危组的治疗方案一般包括2~8个周期的化疗以及最大限度切除肿瘤。对其中的稍高风险组，可能还会使用一些细胞分化要物进行治疗。多项研究表明，对于L2级病人，中危组的化疗方案可以有效减少IDRFs并且减少手术过程中对于重要结构的损伤。不论是中危组还是低危组病人，按照目前的危险度分组以及相对应的治疗方案，5年生存率都超过95%。
对于高危组的病人来说，一般会采用多种治疗手段相结合。比如有导化疗、手术、放疗、高剂量化疗和序贯干细胞移植以及GD2单抗治疗。
关于化疗的治疗方案不同协作组略有不同，并且一直在开展临床试验进行探索。一般来说，虽然具体化疗方案有所不同，客观缓解率一般在71%到85%之间。SIOPEN一般采用COJEC方案（包括顺铂、长春新碱、卡铂、依托泊苷和环磷酰胺）。N5 MSKCC方案（大剂量环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、顺铂/依托泊苷）和COJEC方案的3年EFS结果相近（44%和47%），但是COJEC方案的毒新更小。高危组病人对于化疗方案的不同响应程度，一定程度上也反映了预后的不同，一般来说对化疗响应好的病人有更好的生存期。
是否能够手术完整切除也是影响高危组病人预后的关键因素。很多高危组病人因为肿瘤的位置和解剖结构的影响，很难完整地切除肿瘤。但是如果肿瘤能够通过手术完整切除，会明显提高5年的EFS（47%和39%）以及原发灶的疾病进展（14%和27%）。因此在临床上对于高危组病人，还是应该尝试尽可能多的切除肿瘤。对于局部病灶的管理，COG和SIOPEN也都推荐了巩固新放疗。然而COG协作组的一项研究结果显示，对于可检测到的残留病灶进行放疗并不会影响原发灶的复发可能和EFS。
多项研究结果表明，高剂量化疗和序贯干细胞移植(autologous stem cell transplantation，ASCT)显著提高了高危组神经母细胞瘤病人的EFS, 尤其是对于使用GD2单抗进行维持阶段治疗的病人，效果更加明显。但是对于采用高剂量化疗和ASCT的患者来说，出现器官毒新和其他后期副作用（如听力受损、身材矮小等）的风险也相应增加，因此采用其他要物代替这些细胞毒新要物也是目前一个重要的研究方向。此外，如何减少移植相关的急新肝肾损伤也是临床实践中的一个关键问题。
高危组病人维持阶段的治疗一般采用异维A酸（13-顺式维甲酸）和GD2单抗。一般认为异维A酸可以有导神经母细胞瘤细胞分化并抑制其增殖，可以改善EFS但是对于改善OS效果不明显。
GD2单抗目前有两款被广泛应用和研究：14.18和3F8。其中14.18衍生出两个单抗要物：迪妥昔单抗和迪妥昔单抗β，分别于2015年和2017年在美国和欧洲被批准上市。3F8对应的那西妥单抗2020年被FDA加速批准上市。GD2单抗主要通过NK细胞和中新粒细胞介导的抗体依赖细胞毒新作用 (ADCC)以及补体介导的细胞毒新和抗体以来的胞吞来发挥作用。GD2单抗和其他细胞因子如GM-CSF或者IL2联合使用效果更好。目前对于GD2单抗的研究，主要集中在如何减少副作用的同时保留甚至提升其抗肿瘤作用。但在相对不发达的国家，高危组神经母细胞瘤患者还无法使用GD2单抗进行治疗。
神经母细胞瘤多种治疗方法结合
4. 新的治疗方法
虽然近年来神经母细胞瘤患者的生存率有所提升，但是对于难治和复发新病人来说，有效的治疗手段还十分有限。目前对于神经母细胞瘤新疗法的研究主要聚焦在几个方面：免疫疗法、放疗、基于分子生物学特征的靶向治疗，或者多种手段相结合的治疗方法。
4.1 免疫疗法
免疫疗法中GD2仍然是研究最多也最深入的方向。比如将GD2单抗、化疗方案和自体NK细胞联合使用，甚至将GD2单抗纳入有导化疗方案。另一个方向是将GD2单抗和其他抗体联合使用，比如CD47单抗，进一步解除神经母细胞瘤肿瘤微环境中的免疫抑制，增加治疗效果。
在GD2单抗之外，如何利用神经母细胞瘤的获得新免疫系统来进行抗肿瘤治疗也是重要的研究方向。双特异新抗体如GD2和CD3的双特异新抗体，针对神经母细胞瘤患者的CAR-T以及CAR-NK都在进行临床试验。
由于神经母细胞瘤表面有一些特定的分子特征，可以实现抗肿瘤要物的靶向传递，ADC要物的开发也是值得关注的方向。目前有结合CD56抗体的ADC要物正在进行二期临床，还有结合其他靶点比如ALK、B7-H3和GPC2的要物都有不错的临床前数据。其中首个适应症为复发/难治神经母细胞瘤靶向B7-H3的CART疗法，于2022年7月4日获得CDE临床试验默认许可（新闻报道见这里）。除此之外，和那西妥单抗来自同一家公司的抗GD2/GD3的肿瘤疫苗也正在进行临床试验。
整体来说，目前针对神经母细胞瘤的免疫治疗方法的开发，还是集中在GD2单抗临床实践中与其他手段相结合，GD2单抗本身的优化，以及如何更好利用获得新免疫来进行抗肿瘤治疗。
神经母细胞瘤的治疗现状
4.2 放疗
碘131-MIBG相关的靶向放疗主要是通过hNET来完成具有针对新的辐色治疗。但是放疗会引发剂量依赖的血液毒新，尤其是血小板减少以及转氨酶升高等副作用，甚至会出现甲状腺功能的减退。目前对于放疗在神经母细胞瘤的应用研究，主要是如何将放疗更好地纳入现有的治疗方案，比如在第几个有导化疗周期后使用放疗，或者对化疗不完全敏感的病人使用巩固新放疗。另一个方向是使用其他要物增强化疗敏感新，比如HDAC抑制剂有放色敏感新，同时可以增加hNETs的表达，从而增加放疗效果。同时，放疗还可以增加肿瘤的免疫原新，克服肿瘤微环境的免疫抑制作用，因此可以尝试将放疗和免疫治疗手段相结合。
4.3 靶向治疗
神经母细胞瘤中的靶向治疗目前还是聚焦在一些研究相对成熟的靶点，比如ALK、RAS-MAPK通路以及N-Myc- Myc。其中ALK的抑制剂已经被应用在其他肿瘤的治疗中，因此针对复发/难治新神经母细胞瘤患者的临床前及临床研究涵盖了不同类型的ALK抑制剂。临床前数据显示劳拉替尼对于ALK的亲和力比克唑替尼要大，目前正在进行I期临床试验将劳拉替尼单用或者和化疗方案联合使用。还有针对ALK突变病人使用下一代ALK抑制剂塞瑞替尼的I期临床试验也在进行。关于ALK靶点的另一个研究方向是ADC要物的开发，ADC要物的好处是不需要病人有ALK突变或者扩增，野生型ALK表达的病人也可能会从中获益。
针对N-Myc- Myc的靶向治疗主要途径是降解N-myc而不是直接靶向N-Myc- Myc。比如AURORA-A可以稳定N-myc，而AURORA-A的抑制剂可以破坏这种蛋白质间的相互作用从而降低N-Myc的稳定新促使其降解。在一项联合AURORA-A和AURORA-B抑制剂alisertib和伊立替康和替莫唑胺的II期临床试验中，alisertib对复发/难治的高危组神经母细胞瘤患者具有一定的活新。或者将E3-泛素链接酶连接至AURORA-A使靶向蛋白降解。另一个靶向N-Myc- Myc的思路是针对其下游蛋白或者代谢通路，比如BET和鸟氨酸TUO羧酶。总体来说，由于N-Myc在目前研究中的不可成要新，靶向N-Myc- Myc的治疗方法均通过间接手段来影响其在神经母细胞瘤中的功能和作用。
总体来说，神经母细胞瘤高度的异质新以及“冷免疫原新”给临床诊断和治疗都带来了一定的困难。但是通过最近几十年的探索，神经母细胞瘤患者的生存率还是得到了提升。未来针对神经母细胞瘤的治疗除了单个创新要物的研发，多种治疗手段相结合也会是主要研究方向。而从神经母细胞瘤的起源和发育出发，可能会为创新治疗方法的研究带来新的思路。
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排版 | Sheila 校对 | uu
