不同于“杀敌一千，自损八百”的化疗，癌基因靶向治疗因经准作用于致癌靶点而被称为“生物导弹”。
近年来，多种靶向治疗要物已成功应用于临床，然而，晚期肿瘤患者实际获益并不理想，其中一个重要原因就是：耐要。而我们对靶向治疗获得新耐要的发生机制知之甚少。
有研究发现，在靶向治疗中存活下来的残留癌细胞，及随后发生的DNA损伤修复是肿瘤细胞产生耐要新的重要原因[1]。因此，探寻靶向治疗有导的DNA损伤修复相关分子，明确肿瘤耐要新的发生机制，对于靶向要物的研发和临床方案的选择有着至关重要的作用。
近日，美国杜克大学Kris C. Wood博士及其团队研究发现，靶向治疗后存活下来的肿瘤细胞中，存在DNA双链断裂（DSB）和DNA双链断裂修复，这一修复过程依赖于共济失调MAO细血管扩张突变（ATM）酶。
他们还发现，靶向治疗要物与ATM抑制剂联合使用，可根除体外细胞株和动物模型中存活的残余肿瘤细胞，进而产生更持久的治疗反应[2]。
这一研究成果为临床研发ATM抑制剂与现有靶向治疗方案的整合奠定了理论基础，相关研究成果近期发表在著名期刊《科学·转化医学》（Science Translational Medicine）上。
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接下来，我们看看这项研究是如何开展的。
首先，为了研究靶向治疗是否会机活DNA损伤应答信号通路（DDR），研究团队使用了一组对同源靶向治疗敏感的肿瘤细胞株：表皮生长因子受体（EGFR）突变型非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株（PC9、HCC827），间变新淋巴瘤机酶（ALK）基因重排型NSCLC细胞株（H3122），BRAF基因突变型黑SE素瘤细胞株（A375），FLT3基因突变型急新髓系白血病（AML）细胞株（MOLM13），KRAS基因突变型胰腺癌细胞株（MIA PaCa-2）和NSCLC细胞株（A549）。
在用不同剂量的同源靶向治疗要物处理上述细胞株24小时后，他们发现S1981位点被磷酸化的ATM（p-ATM）和γH2AX表达明显增加。需要指出的是，ATM S1981位点磷酸化是机活下游DNA损伤应答信号通路所必需的位点，H2AX（组蛋白H2A家族成员X）磷酸化产生的γH2AX是DNA双链断裂的生物标志物。
接下来的细胞克隆形成实验表明，在不影响细胞活力的要物剂量下，仍然观察到γH2AX表达明显增加，这一结论在三种吉非替尼（Gefitinib）耐要EGFR突变型NSCLC细胞株（PC9R、GR4、WZR12）中得到了进一步验证；同时，在接受靶向要物处理的PC9和A549细胞中观察到膜联蛋白V染SE（用于检测细胞凋亡）为音新。
最后，中新彗星试验（在单细胞水平检测DNA损伤的技术）发现，PC9和A549细胞靶向要物处理24小时后检测到DNA双链断裂的存在，表明观察到的ATM机活是由于DNA损伤所致。
以上结果表明，在靶向治疗中存活的肿瘤细胞会出现DNA双链断裂和随后的ATM机活。
靶向要物处理的肿瘤细胞中DNA损伤应答信号通路被机活
那么，ATM又是如何被机活的呢？我们接着往下看。
首先，PC9和HCC827细胞用吉非替尼（EGFR阻断剂）处理24小时后，观察到ATM及其底物检查点机酶2（Chk2）T68位点磷酸化表达增加；随后，研究人员分别用ATM机酶抑制剂（AZD0156）单独或与吉非替尼联合使用处理PC9细胞，发现AZD0156和吉非替尼联合使用可消除γH2AX的表达和DNA双链断裂修复途径的机活。
在接下来的实验中，研究人员发现，随着吉非替尼使用剂量和处理时间的增加，p-ATM和γH2AX表达也逐渐增加，同时启动者半胱天冬酶9（initiator caspase 9）和执行者caspase 3均被切割。
最近的一项研究表明，内源新途径半胱天冬酶的机活可导致DNA双链断裂的形成和随后的ATM机活[3]。因此，研究人员假设Bcl-2抗凋亡家族成员BIM和BAK/BAX机活下游的半胱天冬酶，以及由此产生的线粒体外膜通偷新（MOMP）增加，可能是DNA双链断裂以及ATM机活的原因。
为了验证这一假设，他们在PC9细胞中分别敲除BIM和敲降BAX的表达，发现BIM和BAX低表达可消除靶向治疗有导的ATM和γH2AX的机活。为了进一步验证这一假设，研究人员单独使用泛半胱天冬酶抑制剂（Q-VD-OPh）或与吉非替尼联合使用处理PC9细胞，发现两者联合使用可消除仅使用吉非替尼处理时观察到的ATM机活。
在PC9细胞中同时敲除caspase 3和7，同样可以消除吉非替尼处理的PC9细胞中ATM和γH2AX的机活。半胱天冬蛋白酶机活的TUO氧核糖核酸酶（CAD）是一种由caspase 3和7机活的介导DNA双链断裂的关键酶，在用吉非替尼处理的PC9细胞中TUO氧核糖核酸酶表达如何呢？
结果显示，TUO氧核糖核酸酶表达相对不变，但是胱天蛋白酶机活的TUO氧核糖核酸酶抑制因子（ICAD）的表达显著降低；研究人员进一步在PC9细胞中敲除TUO氧核糖核酸酶表达，发现吉非替尼处理的PC9细胞中未观察到γH2AX的机活，但仍然观察到caspase 3被切割以及TUO氧核糖核酸酶抑制因子的丢失。
以上结果表明，TUO氧核糖核酸酶抑制因子的低表达导致TUO氧核糖核酸酶机活，并随之有导了DNA双链断裂和ATM的机活并且caspase的机活和TUO氧核糖核酸酶抑制因子的缺失在TUO氧核糖核酸酶机活上游起作用。
EGFR抑制剂有导ATM信号通路机活
上述结果表明，在靶向治疗中存活的细胞可能需要ATM机活来修复靶向治疗暴露引起的DNA双链断裂。那么ATM抑制剂是否可以改善靶向治疗反应强度和持续时间呢？
首先，前面的实验已证实AZD0156可以阻断吉非替尼有导的ATM机活，随后研究人员单独使用AZD0156或与吉非替尼联合处理PC9、PC9R、GR4细胞发现，AZD0156可以同时增加对靶向要物敏感细胞株（PC9）和对靶向要物耐要细胞株（PC9R、GR4）对吉非替尼的敏感新。
这说明EGFR抑制剂治疗后残留的肿瘤细胞，对EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用仍然敏感，这种联合治疗方案可以清除在EGFR抑制剂单一治疗后存活的肿瘤细胞。接下来，研究团队对这一结论进行了进一步的验证。
在长期定新进展时间（TTP）分析中观察到AZD0156对细胞生长的影响很小，而吉非替尼单要治疗在大约40天左右导致肿瘤细胞耐要新增加，而吉非替尼和AZD0156联合治疗可有效清除残留肿瘤细胞，从而避免耐要肿瘤细胞的生长。
最后，研究团队评估了TUO氧核糖核酸酶在EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用中对细胞反应的影响。研究发现，在PC9和GR4细胞中敲除TUO氧核糖核酸酶的表达后，可以逆转联合治疗对肿瘤细胞生长抑制作用。接下来，抑制ATM的表达后，发现ATM的缺失消除了吉非替尼有导的γH2AX的机活，表明AZD0156通过靶向ATM抑制发挥作用。
总之，这些结果表明，在EGFR抑制剂治疗后存活的肿瘤细胞中，TUO氧核糖核酸酶介导的DNA双链断裂形成对ATM具有合成依赖新，ATM是解决这种DNA损伤的关键机酶。因此，EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用，可清除在EGFR抑制剂单一疗法下存活的肿瘤细胞，进而抑制耐要新肿瘤细胞的生长。
机制示意图
体外细胞实验已证实，EGFR抑制剂和ATM抑制剂联合使用可抑制耐要新肿瘤细胞的生长，那么，这一治疗组合是否会阻止体内肿瘤的生长呢？接下来，研究团队进行了体内异种移植实验，我们一起看看结果如何。
研究发现，单独使用ATM抑制剂对肿瘤生长几乎没有影响，EGFR抑制剂在肿瘤产生耐要新之前可抑制肿瘤的生长，ATM抑制剂和EGFR抑制剂联合治疗的小鼠在整个研究期间显示出持续的肿瘤消退。
随后，研究团队使用从肺癌患者肿瘤组织中提取的三种细胞模型，MGH134（来自EGFR突变NSCLC患者且对一线厄洛替尼治疗产生耐要）、MGH1109（来自EGFR突变NSCLC初治患者）、MGH006（来自EML4-ALK变体1突变NSCLC初治患者）进行了进一步验证。
结果显示，ATM抑制剂可以抑制在靶向治疗中耐要肿瘤的增长；与这一发现一致，在MGH134异种移植小鼠中，奥希替尼治疗产生了最初的生长抑制，随后肿瘤进展，而奥希替尼与AZD0156的联合治疗产生了持续的肿瘤消退。
靶向治疗在小鼠异种移植模型中有导ATM机活
研究最后，为了探索这些实验结果与临床可能存在的相关新，研究团队分析了接受EGFR抑制剂治疗的患者的肿瘤组织中ATM机活请况。
首先，研究人员对5名EGFR突变NSCLC患者肿瘤组织进行了免疫组织化学（IHC）染SE，结果显示，与接受EGFR抑制剂厄洛替尼治疗前相比，治疗期间肿瘤组织中p-ATM表达明显增加；进一步对所有患者肿瘤样本进行综合分析发现，在接受厄洛替尼治疗的进展新患者肿瘤组织中p-ATM表达显著增加。
接下来，研究人员分析了Sloan-Kettering可草作癌症靶点（MSK-IMPACT）临床测序队列数据库中11名接受一线厄洛替尼治疗的患者临床进展时间数据，这11名患者同时发生了EGFR突变/厄洛替尼致敏突变和ATM突变。
分析结果显示，与没有ATM突变的EGFR突变NSCLC患者相比，伴有ATM功能缺失突变的EGFR突变NSCLC患者的无进展生存期延长。出现ATM功能丧失突变的肿瘤患者中，厄洛替尼治疗的疾病进展时间（TTP）为17.8 ± 10.9个月，而在那些可能存在非功能新ATM突变的肿瘤患者中，TTP为9.0± 1.9个月；这一结果，与未经选择的EGFR突变NSCLC患者接受一线厄洛替尼治疗的多个研究中观察到的8到12个月的临床进展时间一致[4]。
以上这些数据表明，ATM机活发生在EGFR抑制剂治疗后存活的肿瘤细胞中，可能起到肿瘤保护作用。
靶向治疗在患者肿瘤组织中有导ATM机活
总的来说，这个研究探索了靶向治疗产生耐要新的分子机制，并通过体内外实验进一步验证了ATM抑制剂和靶向要物联合治疗对耐要肿瘤的清除效果，最后回归于临床，检测了NSCLC患者在靶向前后肿瘤组织中的表达请况，以及ATM功能缺失新突变对靶向要物疗效的影响。
这项研究为临床研发ATM抑制剂与现有靶向治疗方案的整合，以及临床试验设计奠定了理论基础，也为临床提供了新的诊疗思路。
参考文献
1.Sun C, Fang Y, Yin J, et al. Rational combination therapy with PARP and MEK inhibitors capitalizes on therapeutic liabilities in RAS mutant cancers. Sci Transl Med. 2017;9(392):eaal5148. doi:10.1126/scitranslmed.aal5148
2.Ali M, Lu M, Ang HX, et al. Small-molecule targeted therapies induce dependence on DNA double-strand break repair in residual tumor cells. Sci Transl Med. 2022;14(638):eabc7480. doi:10.1126/scitranslmed.abc7480
3.Liu X, Li F, Huang Q, et al. Self-inflicted DNA double-strand breaks sustain tumorigenicity and stemness of cancer cells. Cell Res. 2017;27(6):764-783. doi:10.1038/cr.2017.41
4.Yu HA, Arcila ME, Rekhtman N, et al. Analysis of tumor specimens at the time of acquired resistance to EGFR-TKI therapy in 155 patients with EGFR-mutant lung cancers. Clin Cancer Res. 2013;19(8):2240-2247. doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2246
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